一．     实验原理及试剂配置

1.       实验原理

P I , 即碘化丙锭，可以与细胞内 DNA 和 RNA 结合，采用 RNA酶将 RNA 消化后 , 通过流式细胞术检测到的与 DNA 结合的 P I 的荧光强度直接反映了细胞内 DNA含量的多少 。 由于细胞周期各时相的 DNA 含量不同 , 通常正常细胞的 G 1/ G 0 期具有二倍体细胞的 DNA 含量 ( 2N) ,而G 2/ M 期具有四倍体细胞的 DNA 含量 ( 4N) ,而 S 期的 DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术P I染色法对细胞内 DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G 1/ G 0 期，S 期和G 2/ M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。值得注意的是，PI不能通过细胞膜完整的细胞 (如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时 , 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性 , 才能使 P I进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。

2.       试剂配制

RNase A，注意分装保存，防止反复冻融。

PI 购自Sigma公司货号P-4170，通常用过滤除菌的PBS配置成500mg/ml的储液避光保存备用，细胞染色时用PBS稀释到50mg/ml。

二．     实验步骤

1.       细胞的收集：将处理好的细胞样品组用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS终止消化后，200g离心3min沉淀细胞。

2.       细胞的固定：将离心收集的细胞用500mL预冷的PBS悬起，200g离心3min沉淀细胞，弃上清，以充分去除残留的FBS和胰酶；加入-20℃预冷的70%乙醇500mL悬浮细胞，于4℃固定30min或-20℃固定过夜。（此处，加乙醇时应注意边加入变吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测）

3.       RNA的去除：将固定好的细胞，200g离心5min沉淀细胞弃去上清液；500mL预冷的PBS悬浮细胞，200g离心3min沉淀细胞，弃去上清液；用500mL 100mg/ml的RNase A在37℃下温育30min以充分降解细胞内RNA。

4.       PI染色：将RNase A处理的细胞200g离心3min沉淀，弃去上清液；200mL浓度为50mg/ml的PI染液悬浮细胞，冰上放置避光染色30min。

5.       上机测试：用BD流式分析仪对样品进行测试，测试前注意矫正参数，以优化实验结果；每个样品采集10000个细胞进行周期分析。

6.       结果分析：采集的细胞周期结果用Summit4.0软件进行分析，计算G1/G0、S期、G2/M的细胞比率，重复实验3-4次，对结果进行统计。

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